人抗肌聯蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒應用競爭抑制酶標免疫分析法測定標本中待測物質水平。用純化的抗原包被微孔板，往包被抗體的微孔中同時加入酶標的抗體和待測抗體，被測抗體與酶標記抗體對特異性抗原進行競爭結合。經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。待測標本濃度越高，標記抗體和抗原的結合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關，而與樣品中待測物質含量呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制 
1.         酶聯板：一塊(96孔) 
2.        標準品(凍干品)：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100pmol/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋100 pmol/ml， 50 pmol/ml，25 pmol/ml，12.5pmol/ml， 6.25 pmol/ml，3.12 pmol/ml，1.56 pmol/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0pmol/ml，臨用前15分鐘內配制。
如配制50 pmol/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100pmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.        樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.        檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5.        檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
6.        檢測溶液A：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
7.        檢測溶液B：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.         底物溶液：1×10ml/瓶。
9.        濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
10.     終止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 
標本的采集及保存 
1.        血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.        血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 xg離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.         其它生物標本：請1000 xg離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：以上標本置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。
 
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立*稀釋倍數。
1.        加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內配制)，37℃,60分鐘。
3.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。 
4.        每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul，37℃，60分鐘。
5.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
6.        依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色(30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。
7.        依序每孔加終止溶液50ul，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.        用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測。
注：
1.        每次實驗留一孔作為空白調零孔(不同于空白孔)，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2.        嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。
3.        洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內液體。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。
4.        消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
5.        在儲存和溫育時避免強光直接照射。
6.        未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用，請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應置于37℃溫育30分鐘；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
7.        建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
 
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需
要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人抗titin抗體，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
 以標準物的濃度為橫坐標(對數坐標)，OD值為縱坐標(普通坐標)，在半對數坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curveexpert1.3)，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1.        洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2.        一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用多道移液器加樣。
3.        請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
4.        如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5.        在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6.         底物請避光保存。
檢測范圍：1.56 pmol/ml - 100 pmol/ml
zui低檢測限：0.78 pmol/ml
說明 
1.         在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
2.         小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 /標準品，酶結合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
3.         試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。
4.         濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 
5.         剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響。 
6.         中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
7.         所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
8.         有效期：6個月